玉米芯强化生物反应器对罗非鱼

循环养殖废水脱氮效果研究

邵 留1，2，3 ，兰燕月 1 ，姬芬1 ，张昊1 ，严铭1 ，张饮江 1，2

摘 要: 研究了以玉米芯同时作为反硝化碳源和生物膜载体的人工强化生物反应器对罗非鱼(Oreochromisspp． )循环养殖废水的脱氮效果，并对新型反应器脱氮微生物多样性进行了分析。结果表明，实验室条件下，人工强化挂膜方式可明显缩短装置的启动时间，新型脱氮装置具有良好的脱氮效果，氨氮可从(8． 00 ±2． 22)mg·L－1 降至 3． 50 mg·L －1 ，硝酸盐可从(31． 50 ± 1． 57)mg·L －1 降至 0． 5 mg·L －1 ，较好地实现了高溶氧养殖废水的同步硝化反硝化作用，总氮去除率达 85%以上。微生物群落结构分析表明，人工富集培养的硝化菌和反硝化菌均较为成功，随着装置运行时间的延长，玉米芯表面生物膜菌群也随之发生变化，参与脱氮的硝化细菌菌属主要由亚硝酸螺菌属 (Nitrosospira)、亚硝酸单胞菌属 (Nitrosomonas)、亚硝酸球菌属(Nitrosococcus)3 个属组成;丰度较大的反硝化菌属为产碱菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)。

关键词: 农业废弃物; 碳源; 同步硝化反硝化; 生物膜载体; 循环养殖系统

循 环 养 殖 系 统 ( Ｒecirculating aquaculturesystems，ＲAS)与传统养殖模式相比，具有集约化、高产率、节水、节地等优点，是水产养殖行业发展必然趋势。但是其集约化养殖模式导致投饵增加，残饵增多，加之鱼体生理代谢产生大量氮磷等营养物质，加速水质恶化。大多循环养殖系统中，主要采用生物过滤器的硝化作用将毒性较强的氨氮和亚硝酸盐转化为毒性较弱的硝酸盐，来保证鱼类的安全与有效生长，却忽略了硝酸盐大量积累对养殖对象的影响。DAVID 等研究表明硝酸盐浓度的累积明显抑制虾类存活率，引发胰腺病变，降低产量;另外，高浓度的硝酸盐条件下，水生动物组织发育减缓、激素分泌功能下降，生理机能变弱甚至死亡。相关研究表明循环养殖系统中硝酸盐安全浓度为 50 mg·L－1 以下，但目前循环养殖系统应用反硝化作用来降低硝酸盐浓度技术尚不成熟 ［8］ ，一般多采用换水来保证系统中硝酸盐浓度不超标，并不能从根本上解决硝酸盐积累问题。本研究设计了一种可有效降低养殖废水中氮浓度的新型脱氮技术工艺，主要针对养殖水体C/N 比偏低，溶氧偏高等特点，采用研究较少的农业废弃物———玉米芯作为反硝化碳源和生物膜载体，通过人工强化挂膜方式建立同步硝化反硝 化 脱 氮 系 统 ( Simultaneous nitrification anddenitrification，SND)，该系统对节约水资源，减少养殖活动对环境污染，以及发展可持续的生态渔业都具有重要意义与学术价值。本研究试图在实验室条件下通过检测进出水的水质变化，探索新型工艺的脱氮效果，并对新型装置的脱氮机理进行初步分析，以期为集约化工厂循环养殖系统水质改善提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1． 1 玉米芯脱氮强化反应器

新型反应器设计如图 1 所示，柱状反应器材质为有机玻璃，参数为 20 cm(D) × 47 cm(H，有效水深)，养殖废水由储水池经蠕动泵进入反应器，控制流速为(20 ± 0． 31)mL·min－1 ，装置运行前将已人工强化挂膜的玉米芯(干重为 1 kg)投入柱状反应器内。

1． 2 玉米芯表面挂膜流程

硝化菌富集培养:选取鱼塘底泥作为接种物，加入自行配制的培养液后于 25 ℃ 恒温培养20 d，控制 pH 在 7． 2 ～ 7． 5 之间，充气使 DO 保持在 4 mg·L－1 以上;硝化菌培养液采用改良的Stephenson 培养液。

反硝化菌富集培养:实验所用菌种污泥来源于上海市滨海污水处理厂，取回后的活性污泥用反硝化菌富集培养液(KNO 3 2． 0 g·L－1 ;K2 HPO 40． 5 g · L－1 ; MgSO4· 7H 2 O 0．2 g · L－1 ;C 4 H 4 KNaO 6 ·4H 2 O 20 g·L－1 )富集培养7 d。培养期间充氮气排除水体溶解氧，维持厌氧环境。

微生物富集培养成功后，先将玉米芯投入反硝化菌液中充分浸泡 1 d，再将富集培养好的硝化菌用喷壶均匀喷洒在已浸泡过反硝化菌的玉米芯外层。

1． 3 实验用水

根据前期监测罗非鱼(Oreochromis spp． )ＲAS系统水质指标，取上海海洋大学校内湖水经 0． 45μm 膜过滤后，添加适量 KNO 3 、NH 4 Cl、KH 2 PO 4配置实验污水，具体进水水质指标如表 1 所示。

1． 4 实验分析方法及数据处理

装置进出水水样每 2 d 取一次，采用国标法测定相关指标。其中，TN:过硫酸钾氧化-紫外分光光度法，NO－2-N:N-(1 － 萘基)-乙二胺光度法，NO－3-N:紫外分光光度法，NH+4-N:纳氏试剂光度法;TOC:采用总有机碳分析仪测(TOC-V．CPH，岛津)测定;水温、DO、pH 采用多参数水质测量仪(YSI556MPS，美国维赛公司)测定。

实验共选取 6 个不同时间点，采集菌液及玉米芯表面生物膜样品，具体采样时间见表 2。采集后的样品经 DNA 提取及 PCＲ 扩增后送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用高通量分子测序技术对微生物群落结构分析(表 3)。技术方法为:提取样品总 DNA → PCＲ 扩增和产物纯化→PCＲ 产物定量和均一化→ Miseq PE 文库制备→Miseq 高通量测序→生物信息分析实验所得数据均记录为“算术平均值 ± 标准差”(Mean ± SD)，利用 SPSS 17． 0 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2． 1 装置对氮的去除效果

实验期间装置出水 NH+4-N、NO -3 -N、TN 浓度及去除率变化如图 2(A，B，C)所示，经人工强化挂膜后，新型脱氮装置启动迅速，运行第 1 d 装置氨氮、硝 酸 盐 和 总 氮 的 去 除 率 分 别 达 到 了56． 50%、97． 63%和 86． 08%。实验前期(1 ～ 35 d)，系统保持稳定运行状态，该阶段水温一直稳定在 20 ℃以上，TN、NO -3 -N、NH+4-N 去除率均保持较高水平。由图 2-A 可以看出，实验前期装置 NH+4-N 较高去除率为64． 64%，较低为 46． 38%，出水 NH+4-N 浓度平均为 3． 50 mg·L－1 ，装置具备一定的硝化效果。出水 NO -3 -N 浓度及去除率变化如图 2-B 所示，NO-3 -N 去除率高达 98． 80%，较低为 95． 25 %，出水浓度保持在 0． 89 mg·L－1 左右，这说明即使在高DO(平均 DO ＞ 4 mg·L－1 )条件下，装置依旧获得了良好的反硝化效果;装置出水 TN 浓度及去除率变化如图 2 － C 所示，出水 TN 平均浓度为7． 88 mg·L－1 ，TN 较高去除率为 86． 61 %，较低时为 76． 61 %;综上所述，实验前期新型装置启动迅速，且具有良好的同时硝化反硝化脱氮能力。实验中期(37 ～ 43 d)，水温降至 15 ℃左右，出水水质波动较为剧烈，装置 TN、NO -3 -N 及NH+4-N 去除率均出现明显下降。第 43 天，TN、NO -3 -N 及 NH+4-N 去除率均降至较低，分别仅为43． 12 %、49． 68 %和13． 35 %。第44 天，水温回升后 NH+4-N、NO -3 -N、TN 去除率均出现不同程度上升，其中 NO -3 -N 和 TN 去除率较高分别回升至78．79 %和 63． 94 %。但去除率依然低于实验前期，这可能是由于生物膜上微生物受温度突降影响较大，微生物群落结构发生了显著变化。后续的微生物分析结果验证了这一猜想(图 4)。

实验后期(≥65 d)，NO -3 -N、TN 去除率出现逐步下降趋势，系统 NH+4-N 去除率维持在(20 ～30)%之间。结合图 3 可以看出，运行时间超过65 d 后，出水 TOC 浓度下降明显，含量普遍低于20 mg·L－1 ，这说明碳源玉米芯中易被分解的有机物已消耗殆尽，导致反硝化碳源不足，从而使得装置对总氮的去除率出现下降。

图 3 水温及出水 TOC 浓度

Fig． 3 Changes of water temperature and TOC

2． 2 生物膜微生物群落动态分析